Elektroforesis
merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan
pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul
yang bergerak pada medan listrik tergantung
pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan
demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul
(seperti protein dan asam nukleat).Posisi molekul yang terseparasi pada
gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun
dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis
untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga
untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas
dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis
biasanya memerlukan media penyangga sebagai
tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media
penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan
dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam
elektroforesis antara lain yaitu kertas,
selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid
dan agarosa merupakan matriks penyangga
yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein
yakni: (Soedarmadji, 1996)
1.
Ukuran molekul protein
Migrasi
molekul protein berukuran besar lebih
lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2.
Konsentrasi gel
Migrasi
molekul protein pada gel berkosentrasi rendah
lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel
berkosentrasi tinggi.
3.
Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein
yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas
sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal
ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion
rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat
minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
4.
Medium penyangga
Medium pendukung
ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif
stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai
migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan
ukuran molekulseperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).
5.
Kekuatan voltase
•
Jika ukuran pori dari medium kira-kira
sama dengan molekul, maka molekul yang
lebih kecil akan berpindah lebih bebas
di dalam medan listrik, sedangkan molekul
yang lebih besar akan dibatasi dalam
migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur
dengan mengubah konsentrasi penyusun gel
poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid
•
Voltase yang dipakai rendah (100-500) V,
kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang
digunakan.
•
Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara
lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah
serta jenis arus yang dipakai selalu
harus searah (bukan bolak balik).
6.
Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur
tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein
dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan
bermigrasinya protein.Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan
bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak
tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin
rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein
bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat
molekul lebih besar akan bergerak pada
jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah
(Sumitro et al., 1996). Hasil elektroforesis akan
didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan
berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita
yang terbentuk dari pita protein menunjukkan
kandungan atau banyaknya protein yang
mempunyai berat molekul yang sama yang
berada pada posisi pita yang sama. Hal ini
sejalan dengan prinsippergerakan molekul bermuatan,
yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di
bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama
akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji,
1996).
Tidak ada komentar:
Posting Komentar